公司產品僅供科研實驗產品屬性：

產品名稱：泛素連接酶E3A(UBE3A)重組蛋白   

物種：Homo sapiens (Human，人)

英文名稱：Recombinant Ubiquitin Protein Ligase E3A (UBE3A)

ANCR; AS; E6-AP; EPVE6AP; HPVE6A; Papilloma Virus E6-Associated,Angelman Syndrome; Oncogenic protein-associated protein E6-AP; Renal carcinoma antigen NY-REN-54

酶與激酶

發育科學

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標簽選擇：

親和標簽：蛋白重組表達過程中采用親和標簽融合表達有兩方面的作用：一方面是為了使蛋白純化過程變得更加容易；另一方面是為了促進某些不溶性蛋白可溶。蛋白標簽可分兩類：一類是短肽類標簽；一類是長肽以融合蛋白（fused partner）形式共表達。使用不同的蛋白標簽需要根據具體案例來分析。

不同的系統步驟稍微有些不同的，大致步驟如下：

真核表達系統的重組蛋白表達步驟：

a.      選擇表達載體和宿主細胞（常用的CHO和HEK293）

b.      表達載體的構建

c.      無內毒素的質粒抽提

d.      細胞瞬時轉染

e.      表達小試，條件優化

f.       表達分析和鑒定（SDS-PGAE和WB）

g.      大量表達

h.      親和純化

i.        檢測和鑒定

原核表達系統的重組蛋白表達步驟：

a.      選擇表達載體

b.      密碼子優化

c.      基因合成/亞克隆

d.      轉化表達菌株

e.      蛋白表達小試分析

f.       如果蛋白可溶，蛋白親和純化

g.      如果蛋白不可溶，則需要變復性來制備可溶蛋白。

h.      鑒定，包括SDS-PAGE和WB鑒定

GZMH蛋白；表達蛋白的分析、純化、檢測

　　誘導表達成功后，表達蛋白的分析、純化、檢測應該順當，按一般的實驗步驟做沒太大的問題。

操作步驟 ：

根據使用量，取每 1mL RIPA 加入 10uL PMSF，使 PMSF 的zui終濃度為 1mM。混勻備用（PMSF 現用現加）。

1、樣品前處理：

a)對于貼壁細胞：去除培養液，用 PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍。按照 6 孔板每孔細胞量加入150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。

b)對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞量加入150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液，再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成 50-100 萬細胞/管，然后再裂解。

c)對于組織樣品： 把切成細小的碎片。按照每 20mg 組織加入 150-250 uL 裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量)。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

2、后處理：

將裂解后的樣品 10000-14000g 離心 3-5 分鐘，取上清，即可進行后續的蛋白濃度測定、SDS-PAGE、Western blotting 和免疫沉淀等操作

特點：

標記：標記反應簡單、溫和且很少抑制抗體活性，將與抗體共價結合是一種非常簡便、直接的標記方法。

酶標記：酶標記抗體是將酶與特異性抗體經適當方法連接而成，其應用范圍非常廣泛，結果即時可見、敏感性高。

熒光標記：熒光基團AbFluorTM是新型的熒光標記物之一，產品覆蓋350-770nm。不同的AbFluor基團經恰當的激光可發光， 從而得知抗體的定位和待測抗原的分布情況，主要用于細胞分選或高分辨率免疫染色，是一種非常好的亞細胞水平定位的方法。

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